脂肪酶已成为重要的生物催化剂，具有广泛的工业应用能力。微生物脂肪酶由于其稳定性、选择性和广泛的底物特异性而引起了工业界的广泛关注。在先前的研究中，从豆豉中分离到一种独特的溶脂细菌(黄体微球菌EMP48-D)。事实证明，这种细菌会产生一种酸性脂肪酶，这在生物柴油的生产中很重要。我们的主要目标是克隆酸性脂肪酶并研究其在生物柴油生产中的潜力。
本研究克隆了黄体芽孢杆菌的脂肪酶基因EMP48-D，并在大肠杆菌中异种表达。据我们所知，这是首次从黄体微球菌中克隆和表达脂肪酶基因。该氨基酸序列与一个分子量约为40 kDa的451个氨基酸残基的蛋白核苷酸序列(1356 bp)相对应。信号肽的存在表明该蛋白是细胞外的。序列分析显示该蛋白具有脂肪酶特异性Gly-X-Ser-X-Gly基序。该酶被鉴定为酸性脂肪酶，pH值为5.0。脂肪酸对酶活性的偏好是C8和C12(对硝基苯基酯)，温度在30-40°C时最适宜，在80°C时仍保持活性。该酶还被证明可以将高达70%的底物转化为脂肪酸甲酯。
该酶是一种具有水解和酯交换反应的新型酸性脂肪酶。由于该酶在低温条件下催化反应最佳，且在高温条件下仍具有活性，因此在生物柴油的合成中具有特别的应用前景。
酶的发现已成为生物技术工业的一个非常重要的突破。工业用酶市场的最大份额是水解酶，如蛋白酶、淀粉酶、酰胺酶、酯酶和脂肪酶[1]。在过去的几十年里，脂肪酶(triacylglycerol acyll -hydrolase)作为一种重要的酶在生物技术中出现并得到了迅速的发展[2]。这是由于脂肪酶的多面性，这使得它可以在各种应用中使用[3]。
脂肪酶也是一种在自然界中具有丰富可利用性的酶，可以从各种微生物、动物或植物中分离得到[4]。天培(Tempeh)是一种传统的印尼发酵食品，由大豆发酵制成，使用的是少孢根霉。印尼豆豉是一个具有高度多样性微生物的生态系统[5]，其中一些细菌在脂肪的水解中起作用[6,7]。在大豆发酵过程中，微生物对脂肪的水解使豆豉中游离脂肪酸的含量增加了25-26%[8]。这表明与豆豉有关的其他一些细菌也能够产生脂肪酶。
脂肪酶(EC 3.1.1.3)在酶分类系统中属于羧基水解酶的成员[9]。脂肪酶可以催化酯基的水解和合成[10]。脂肪酶是各种工业应用中最重要的生物催化剂之一，即食品，洗涤剂，药品，化妆品，生物修复和油脂化学品。它约占世界酶市场份额的5 - 10%[2]。在工业应用中，脂肪酶的一些特性包括在高温下的稳定性，对有机溶剂的抗性，以及在低pH条件下的活性。
酸性脂肪酶(在低pH下具有活性)在工业应用中非常重要，特别是在生物柴油生产中[11,12]。生物柴油生产中常用的底物的组成主要是游离脂肪酸。游离脂肪酸的积累导致反应的初始pH值很低，因此在这种条件下使用碱性生物催化剂将更加困难和不经济[13]。酸性脂肪酶是研究最少的脂肪酶类型;到目前为止，只有少数脂肪酶被报道具有这种特性。本研究成功克隆了黄体微球菌EMP48-D酸性脂肪酶编码基因。该基因也已在大肠杆菌BL21中成功表达，并对所产生的脂肪酶的特性进行了一些分析。
用三丁酸甘油酯和tricaprylin琼脂检测脂溶活性。培养基中含有1% (v/v)三丁酸甘油或三丙烯酸酯甘油、1 ×阿拉伯胶溶液、1% (w/v)色氨酸、0.5% (w/v)酵母膏、0.5% (w/v) NaCl和2% (w/v)琼脂。阿拉伯胶溶液(10 ×): 10%阿拉伯胶、200mm NaCl、50mm CaCl2。采用NB琼脂或LB琼脂进行转化验证和回收。为了检测重组菌株的脂溶活性，用氨苄西林(100 ppm)、25 mg/l x -半乳糖苷酶和50 mg/l异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)处理trybutyrin和trycaprylin琼脂。以大肠杆菌DH5作为脂肪酶基因的克隆宿主。克隆载体为含有结构基因脂肪酶EMP48-D的pGEM-T Easy质粒。以大肠杆菌BL21为表达宿主。以pET15-b、pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pG-Tf2、pTf16、pUC19为表达载体。
黄体分枝杆菌EMP48-D是从豆豉中分离得到的[14]。使用Wizard?基因组DNA纯化试剂盒(Promega)对M. luteus EMP48-D进行略微修改提取DNA。加入溶菌酶溶液(100μg/ml)优化微球菌细胞壁裂解。用Lip013引物:5 ' - ccccgacgctagccag -3 '和5 ' -CATCTGCATCCGAGAGACCG-3 '从基因组DNA中扩增基因编码脂肪酶。利用TA克隆技术将扩增子导入质粒pGEM-T Easy中[15]，然后转化大肠杆菌DH5α(图1)。
图1
Lip_EMP48-D在pGEM-T Easy载体上的克隆构建示意图Ori，复制起源;RBS，核糖体结合位点;Ampr，氨苄西林耐药标志
通过凝胶电泳确认携带脂肪酶基因的重组DNA的大小，同时使用AB?遗传分析仪3130 (Applied Biosystem, USA)进行核苷酸测序。利用M13引物(5 ' -GTAAAACGACGGCCAG-3 '和CAGGAAACAGCTATGAC)和Lip013引物从重组质粒中扩增脂肪酶基因。使用genous R.11.1.2 (Biomatters Ltd.， NZ)和MEGA 6.06 (Pennsylvania State University, USA)进行核苷酸序列分析，并与NCBI GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中存储的序列进行同源性鉴定。
用引物LiPML-NdeI 5 ' -GGAATTCCATATGGCCCCCGCACGCC-3 '和LiPML-XhoI 5 ' -CCGCTCGAGTCAGAACCACCCGCACGAGTC-3 '扩增脂肪酶基因的开放阅读框(ORF)。预测的引物包含与NdeI和XhoI位点相对应的核苷酸，用于在正确的方向上靶向基因。采用双消化机制将脂肪酶基因(EMP48-D脂肪酶)连接到表达载体上(图2)。利用热休克法将重组质粒转化到宿主体内[16]。含重组质粒的转化子在含氯霉素(35 μg/ml)和氨苄西林(100 μg/ml)的LB培养基中37℃培养，OD600为0.6。然后调整培养至1 mM IPTG，在30℃下继续孵育24 h。10000 × g离心30 min，收获转化细胞。离心收集的细胞洗涤2次，重悬于10 mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中。悬浮液超声释放细胞内蛋白，无细胞提取液10000 × g离心10 min，清除细胞碎片，检测脂肪酶活性。第一次离心获得的上清液检测细胞内脂肪酶活性。
图2
Lip_EMP48-D在表达载体pET15-b中的表达构建示意图。Ori，复制起源;RBS，核糖体结合位点;Ampr，氨苄西林耐药标志
根据ExPASy蛋白质组学服务器的自动网络服务，使用FASTA、CLUSTALW和T-Coffee进行初始比对。蛋白质结构预测是在SWISS-MODEL服务器上使用同源结构建模程序半自动生成的(https://swissmodel.expasy.org)[17]。然后通过视觉分子动力学(VMD)软件v.1.9.3 (University of Illinois, USA)对模型进行可视化。建模所用模板为C. antarctica CalA (2veo.1.A)脂肪酶A的晶体结构。采用genous R.11.1.2软件(Biomatters Ltd.， New Zealand)进行酶位点预测。脂肪酶功能成分预测使用phobius基于web的预测服务器(http://phobius.sbc.su.se/cgi-bin/predict.pl)和SignalP 4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)。
用对硝基苯(p-NP)酯作为底物分光光度法测定脂肪酶活性[18]。用2 mm p- np -月桂酸酯(C12)乙腈溶液、150 mm柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH 5.0)和10 μ l粗酶配制标准反应混合物(1.0 ml)。空白反应与实验混合物进行相同，不包括酶。37℃孵育5 min，在405 nm处测定对硝基苯酯对硝基酚的释放量。根据生产程序，用bicinchoninic acid (BCA)试剂盒(Thermoscientific)和牛血清白蛋白(BSA)作为蛋白质标准来估计蛋白质数量。脂肪酶活性单位(U)定义为每分钟催化1 μmol p-NP转化的特定酶的数量，而特定酶活性单位(U/mg)表示为每毫克蛋白质的酶的数量。
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是根据Laemmli[19]提出的方法进行的，稍作修改。酶谱图按照SDS-PAGE工作程序进行。染色步骤改为SDS-PAGE凝胶在1% Triton X-100中浸泡2 × 30分钟，然后用蒸馏水冲洗60分钟。然后将凝胶置于三丁酸酪氨酸琼脂培养基上，在37℃下孵育8小时，或直到可见透明区。将三丁酸甘油酯培养基上的清晰带与SDS-PAGE凝胶上的分子量标记进行比较，获得分子量范围(MW)。
在标准条件下，对硝基苯基丁酸酯(C4:0)、对硝基苯基己酸酯(C6:0)、对硝基苯基癸酸酯(C8:0)、对硝基苯基癸酸酯(C10:0)、对硝基苯基月桂酸酯(C12:0)、对硝基苯基棕榈酸酯(C16:0)和对硝基苯基硬脂酸酯(C18:0)对底物特异性进行了分析。在20 ~ 100℃的温度范围内，对酶活性的最佳温度进行了测试。通过测定酶在50°C、65°C和80°C条件下孵育240 min后的剩余活性来确定热稳定性。在37°C条件下，在3.0 ~ 10.0的不同pH范围内确定了最适pH。通过测定酶在pH为4.0、7.0和9.0的条件下孵育180分钟后的剩余活性来检测酶的pH稳定性。通过测定酶在有机溶剂中与50:50 (v/v)的有机溶剂(甲醇、乙醇、丁醇、2-丙醇、乙腈、正己烷和正庚烷)在37℃孵育180分钟后的剩余活性来测定酶在有机溶剂中的稳定性。在标准条件下，通过添加各种金属盐溶液来测定金属离子的影响。即FeSO4, ZnCl2, MgCl2, CaCl2 (0.001 M);KCl, MnCl2 (0.002 M);通过添加0.5%十二烷基硫酸钠(SDS)、1% Tween 80、1% Tween 20、0.5% EDTA、1% Triton X-100和2%甘油来考察各种洗涤剂或抑制剂的效果。在之前描述的标准分析条件下，对每个变量进行了三次独立重复的活性测量。
在恒温恒温的培养箱中持续摇晃10毫升的小瓶中进行酯交换反应。反应过程如下:在游离脂肪酸溶液中加入酶2ml (50u)。将棕榈酸和月桂酸分别作为反应物和溶剂溶于甲醇，得到游离脂肪酸溶液。游离脂肪酸与甲醇的摩尔比为1:3[20]。孵育条件为50℃，225 rpm搅拌5 h。将反应产物分为两相，上相为反应过程中产生的过量甲醇和水，下相为粗脂肪酸甲酯相。脂肪酸甲酯(FAME)相在底部取下，进入离心管进行进一步离心，以去除微量甲醇。FAME上残留的游离脂肪酸有待进一步分析。采用0.05 mol/L NaOH滴定法测定粗脂肪酸甲酯中游离脂肪酸的含量，达到最大转化率。游离脂肪酸的转化率定义为成功转化为脂肪酸甲酯的游离脂肪酸的数量。
摘要。
介绍
材料与方法
结果
讨论
结论
数据和材料的可用性
参考文献。
致谢。
作者信息
道德声明
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将EMP48-D脂肪酶基因与pGEM-T载体连接，产生4.4 kbp的重组DNA。Lip013引物PCR扩增产生1.4 kbp的DNA片段，M13引物扩增产生1.7 kbp的DNA片段。M13引物的附着物分别位于多连接子(polylinker, MCS)的上游176个碱基和下游66个碱基处，因此使用该引物扩增将产生比插入物长约242 bp的片段。用EcoRI对重组质粒进行酶切，得到1.4和3.0 kbp的DNA片段，与DNA插入物和pGEM-T easy载体的大小相似。
利用Lip013引物对黄鳝EMP48-D染色体进行PCR扩增，产生1.414 bp的DNA片段，覆盖整个开放阅读框(ORF)，起始密码子前增加37个碱基(- 37)，终止密码子后增加21个碱基(1.393)。核糖体结合位点(RBS)位于- 15 ~ - 11 (5bp)，转录起始位点(启动子)位于- 35 ~ - 21 (15bp)。ORF大小为1356 bp，编码451个氨基酸残基(AA)。ORF序列携带93个核苷酸(31 AA)的肽信号，表明该蛋白可能被转移到细胞外[21]。氨基酸序列与黄体微球菌trpE16、肺炎链球菌和lylae微球菌的脂肪酶相似(表1)。
表1 blastP EMP48-D氨基酸脂肪酶序列(451 AA)结果
用添加NdeI和XhoI识别位点的LiP-ML引物进行PCR扩增，得到1375 bp的DNA片段。用NdeI和XhoI对DNA片段进行部分切割，得到的DNA片段(1.361 bp)插入载体，转化大肠杆菌。在甘油三酯琼脂平板上选择转化体;DNA插入以白色菌落和清晰的带形表示。然而，含有两种载体的大肠杆菌宿主(白色菌落)在培养基选择中均未表现出脂溶活性(清晰区)。为了确认，对插入的DNA进行测序，发现含有lip - emp48 - d的DNA序列大小和方向正确。
野生型菌株EMP48-D是一种细胞外脂肪酶，其活性最高，为17.02±3.01 U/mg(表2)。如上所述，携带Lip-EMP48-D的质粒存在于大肠杆菌中，在选择培养基上没有任何脂肪酶活性。所以，我们试着提取细胞，其中的上清含有可溶性蛋白质，而颗粒含有不溶性细胞的部分。上清液在三丁酸甘油酯琼脂上仍然没有显示出任何脂溶活性，而来自特定组合(宿主载体)的颗粒则显示出脂溶活性。用pGEM-T easy载体和puc19制备的重组大肠杆菌DH5α微球对三丁酸甘油酯琼脂没有解脂活性。幸运的是，携带pET15-b载体和折纸变体的重组大肠杆菌BL21微球成功地在三丁酸甘油酯琼脂上展示了一个清晰的区域。令人惊讶的是，与使用折纸载体的大肠杆菌BL21相比，携带pET15-b的大肠杆菌BL21在tricaprylin板上显示出更大的清晰区以及脂溶活性(表2)。
表2实验中宿主和载体系统的优化脂肪酶EMP48-D的表达
样品经SDS-PAGE处理。与野生型对照相比，可溶性部分(上清)没有显示出蛋白质条带，而颗粒部分显示出一条IPTG诱导的蛋白质条带(图3a)。SDS-PAGE分析显示在40kda左右形成了诱导带。该大小与预测的40 kDa (1356 bp)相近。然后，用酶图对蛋白带进行确认(图3b)。酶谱图显示在约40 KDa的波段上有一个清晰的带形成。这种偏好正好证实了蛋白质的实际大小肯定在40 KDa左右。
图3
EMP48-D重组细胞不溶性蛋白(颗粒)的SDS-PAGE和b酶谱图。(M)蛋白分子量标记;(0)非诱导重组大肠杆菌粗提物;(125) 125μM iptg诱导重组大肠杆菌颗粒;(250) 250μM iptg诱导重组大肠杆菌颗粒;WT，橄榄油诱导野生型菌株的颗粒;部分纯化的EMP48-D脂肪酶(SDS - page);(Zym)脂肪酶对三丁酸甘油酯底物的溶脂活性
整个脂肪酶基因ORF的核苷酸序列为1.356 bp，编码451个氨基酸残基(图4)。该核苷酸序列以GC含量78%的高GC核苷酸为主。利用SignalP 4.1分析氨基酸序列，发现存在信号肽(31 AA)，并在Ala31和Gln32之间检测到一个切割位点。这是在大多数革兰氏阳性菌中发现的典型肽信号[22]。利用Phobius网络预测服务器分析显示，肽信号序列由10个n区残基(1-10)、13个h区残基(11-13)和8个c区残基(24-31)组成(图4)。从32到451的肽序列制备了一个成熟的脂肪酶，具有非细胞质跨膜拓扑结构的特征[23]。氨基酸序列中信号肽和跨膜拓扑的存在表明EMP48-D在细胞外表达的潜力。在EMP48-D脂肪酶中发现了Gly-X-Ser-X-Gly基序的保守氨基酸结构域(X可以被任何氨基酸取代)。这个基序几乎存在于构成脂肪酶和酯酶的所有氨基酸序列中;有些带有G-D-S-L基序[24]。丝氨酸244 (ser244)、天冬氨酸388 (Asp388)和组氨酸350 (His350)位于催化三联体结构中。丝氨酸是Gly-X-Ser-X-Gly一致序列的一部分(其中X分别代表酪氨酸和谷氨酰胺)。Ser244位于链β6和螺旋α4之间亲核弯头的顶端(图4)。Ser244侧链的作用是将蛋白质主链锚定在一个有利于氧阴离子空穴的位置[25]。
图4
据报道，微球菌科细菌JKS001869 (WP_098471094.1)、M. luteus (WP_101967662.1)、肺炎链球菌(CVM40669.1)、Micrococcus sp. KBS0714 (WP_078025970.1)、lylae微球菌(WP_102214108.1)和terreus微球菌(WP_091698861.1)的EMP48-D脂肪酶与其他已知的脂肪酶之间存在多个氨基酸序列的匹配。α螺旋、β薄片和310螺旋分别与α、β和η相同
脂肪酶EMP48-D为球形，尺寸为35 ? × 36 ? × 42 ?。核心结构由9个被12个α-螺旋包围的β-片链组成(与图4的ORF分析相似)。β-片链的一侧有5个α-螺旋，另一侧有7个α-螺旋(包括仅由4个氨基酸残基组成的α-螺旋)。脂肪酶EMP48-D的二级结构具有与所有脂肪酶相似的α/β水解酶折叠(图5)。由于没有微球菌脂肪酶的晶体结构，我们已将EMP48-D脂肪酶的一级序列提交给Swiss-Model服务器进行自动建模(http://www.expasy.org/spdvb)。通过比较C. antarctica (2veo.1.A)和C. antarctica (3guu.1.A)脂肪酶PDB格式的蛋白质结构建模，生成了EMP48-D脂肪酶的3D模型。然后使用VMD软件观察和标记酶的蛋白质结构，如图5所示。
图5
EMP48-D脂肪酶三维模型。a α-螺旋，β-薄片，随机线圈和β转分别以紫色，黄色和青色的卡通形式显示。b催化三元组(Ser 244, Asp388和His420)放大
为了研究EMP48-D脂肪酶与已知酯酶/脂肪酶的关系，基于酯酶/脂肪酶分类分析了EMP48-D脂肪酶与已知酯酶/脂肪酶的系统发育关系。根据其氨基酸序列和生化特性，细菌酯酶/脂肪酶被分为8个不同的家族[26]。利用CLUSTALW基于p-distance的邻域连接方法，对序列进行了系统发育树的构建。图6所示的树是1000次重复后的bootstrap共识。系统进化树分析表明，EMP48-D脂肪酶与脂肪酶I家族的蛋白密切相关。脂溶性家族I是最具代表性的家族，又分为6个亚家族。根据氨基酸序列比较和系统发育分析，EMP48-D属于I.6亚家族(图7)。来自M. luteus的脂肪酶EMP48-D与来自Streptomyces cinnamoneus和丙酸杆菌acnes的脂肪酶关系更密切。来自Catenulispora acidiphila (WP_015793408)和Williamsia sp. (WP_023956064)的脂肪酶是I.6亚科的其他成员[27]。来自家族I的脂肪酶通常具有Gly-X-Ser-X-Gly一致序列[28]。被归类为I.6亚家族的脂肪酶不仅具有常见的五肽Gly-X-Ser-X-Gly，而且更具体地说，具有Gly-X-Ser-Gln-Gly一致序列(图7b)。有趣的是，所有已知的I.6亚科成员都属于放线菌门。
图6
基于EMP48-D脂肪酶及其他相关酯酶/脂肪酶家族氨基酸序列的系统发育分析[26]。采用MEGA 6.0软件，采用邻居联接法(1000 × bootstrap)构建系统发育树
图7
1 .对I家族(亚家族1 ~ 6)的EMP48-D脂肪酶和其他相关脂肪酶进行系统发育分析。采用MEGA 6.0软件，采用邻居连接法(1000 × bootstrap)构建系统发育树。b对来自i亚家族的EMP48-D脂肪酶和已知相关脂肪酶的多序列比对。U80063:产自肉桂链霉菌的脂肪酶，WP_ 015793408:产自嗜酸Catenulispora的脂肪酶，WP_023956064:产自Williamsia sp的脂肪酶，X99255:产自痤痘丙酸杆菌的脂肪酶
M. Luteus的脂肪酶EMP48-D的多序列比对分析也显示与I.3亚家族的脂肪酶关系更密切(图7a)，但I.3亚家族的脂肪酶的生化特性通常具有更高的分子质量(P. fluorescens, 50 kDa;S. marcesens, 65 kDa)和缺少n端信号肽。黄斑病螺旋体脂肪酶EMP48-D分子量约40 kDa。脂肪酶的分子量与痤菌脂肪酶的分子量相近，分别为33 kDa和26 kDa[29,30]。来自I.3亚家族的脂肪酶通常缺乏EMP48-D中存在的n端信号肽和氨基酸半胱氨酸(Cys)。Angkawidjaja和Kanaya[28]指出，I.3亚家族的脂肪酶通常属于革兰氏阴性菌。
研究了EMP48-D脂肪酶对各种对硝基苯酯的活性(图8a)。在所研究的底物中，EMP48-D脂肪酶对对硝基苯基辛酸酯的相对活性最高(100%)。该酶对月桂酸对硝基苯酯(74%)和己酸对硝基苯酯(66.4%)也表现出良好的活性。对己酸对硝基苯的酶特异性为66.4%。对硝基苯基棕榈酸酯(42.4%)、对硝基苯基硬脂酸酯(38.8%)和对硝基苯基丁酸酯(33.5%)活性最低。短链对硝基苯酯的水解能力较差，而对长链对硝基苯酯的酶特异性强烈表明EMP48-D脂肪酶是一种真正的脂肪酶[31]。
图8
a EMP48-D脂肪酶对多种对硝基苯酯的底物特异性。脂肪酶在各种有机溶剂中的稳定性。所有反应均为三次重复
考察了粗提物对月桂酸对硝基苯酯底物和各种有机溶剂的稳定性。不同有机溶剂对EMP48-D脂肪酶稳定性的影响如图8b所示。与对照相比，丁醇(113%)、2-丙醇(113.5%)、乙醇(105.2%)、甲醇(102%)和乙腈(103.7%)存在时活性最高。正庚烷和正己烷分别使脂肪酶活性降低77.4%和22.1%。
不同金属离子对EMP48-D脂肪酶活性的影响如图9a所示。Mg2+(115%)和Ca2+(111.5%)的存在显著刺激了EMP48-D脂肪酶的活性。其他金属离子Na+和K+对脂肪酶活性的影响较小，分别为90.8%和91.5%。锌离子的存在几乎使脂肪酶的活性丧失(0.5%)。相反，Fe2+离子显著提高了脂肪酶的活性(160.4%)。EDTA对脂肪酶活性的抑制不明显(66.6%)，表明该脂肪酶不是金属酶。各种表面活性剂、氧化剂和洗涤剂成分对脂肪酶活性的影响如图9b所示。在大多数洗涤剂的存在下，脂肪酶的活性丧失了很高的百分比。在Triton X-100、Tween 80和Tween 20存在的情况下，这一比例分别降至39.3%、31.6%和7.2%。在SDS存在的情况下，脂肪酶活性也有较高的损失(7.9%)。甘油有灭活作用，但不显著。
图9
a不同金属离子对EMP48-D脂肪酶活性的影响。b各种洗涤剂和某些抑制剂对EMP48-D脂肪酶活性的影响。所有反应均为三次重复
以pnp -月桂酸酯为底物，酶的最适温度为40℃(图10a)。在80℃条件下，其活性最高为14.79 U/mg，保持45.25%的活性。这表明，黄体芽孢杆菌产生的脂肪酶EMP48-D具有耐热性。酶在50 ~ 65℃稳定100min;然而，在80°C时，酶活性急剧降低。酶在50°C和65°C孵育60 min时几乎完全稳定，孵育180 min后活性分别降至79.1%和37.5%(图10b)。
图10
温度和pH对EMP48-D脂肪酶活性和稳定性的影响。a在pH 5.0的不同温度下测定酶的活性。b在pH 5.0、180 min、不同温度下测定酶的稳定性。c在37℃、不同pH下测定酶的活性。d在37℃、180 min、不同ph下测定酶的稳定性
在pH 3.0 ~ 10.0范围内，研究pH对M. luteus EMP48-D脂肪酶活性的影响，如图10c所示。该酶在pH 5.0时活性最高，在pH 4.0时仍保持84.7%的活性。在室温下培养180 min，其酶活最高可达15.21 U/mg，且完全稳定。该脂肪酶能耐受较低的pH范围，表明该脂肪酶为酸性脂肪酶。然而，当pH值超过5.0时，活性迅速下降，pH值为10.0时达到1.2%。酶的稳定性在pH值为4.0 ~ 5.0的范围内保持相对稳定，在pH值为7.0和9.0时，酶的稳定性在孵育180 min后分别降至71.7%和11.6%的较低值(图10d)。
比较脂肪酶EMP48-D和脂肪酶T.1.2(脂肪酶T.1.2由PT. Wilmar Benih Indonesia提供)对辛酸(C:8)和棕榈酸(C:16)脂肪酸的转化，如表3所示。使用相同的活性单位(20 U)对EMP48-D和T.1.2进行比较。使用相同的活性单位值导致在游离脂肪酸的酯化反应中使用不同量的EMP48-D和T.1.2。考虑到棕榈酸的熔点，在50℃下进行反应。甲醇是逐步加入的，以避免在反应开始时反应介质中有大量的甲醇。EMP48-D在辛酸和棕榈酸底物中的转化率高于T.1.2。EMP48-D在辛酸和棕榈酸中的转化率分别为64.7%和77.2%。脂肪酶T.1.2在酯化反应中的活性低于脂肪酶EMP48-D。与辛酸和棕榈酸反应时，游离脂肪酸转化率分别为55.6%和61.3%。因此，当反应时间从5小时增加到24小时时，转化率没有显著增加，这从经济角度来看是有趣的。
表3脂肪酶以辛酸和棕榈酸为底物催化EMP48-D和T.1.2脂肪酶的酯交换反应
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